Suvremene citogenetičke metode. Genetske metode


Citogenetika je samostalna grana proučavanja nasljeđa koja proučava različite, prvenstveno uočljive (eksplicitne) nosioce podataka o genetskom nasljeđu. Takvi nositelji su kromosomi različite vrste(politene, mitoze i mejotike), plastide, interfazne jezgre i, u manjoj mjeri, mitohondrije.

Temeljem toga, citogenetička metoda je skup metoda i tehnologija za proučavanje, prije svega, kromosoma, pri čemu se utvrđuju njihovi kvantitativni parametri, vrši njihov kemijski i biološki opis, te struktura i načini ponašanja tijekom stanične diobe. studirao. Znanstveni zadatak ovog istraživanja je utvrditi vezu između prirode i dinamike promjena u strukturi kromosoma i slike koja odražava varijabilnost svojstava.

Jedno od najvažnijih područja istraživanja koje uključuje citogenetičku metodu je analiza ljudskog kariotipa. Ova se studija obično provodi na kulturama u kojima dolazi do diobe zametnih i somatskih stanica.

Najčešća kultura za ovu vrstu istraživanja su stanice periferne krvi kao što su limfociti, fibroblasti i stanice koštane srži. Najdostupnija kultura koja se koristi u medicinskoj citogenetici su limfociti krvi. Razlog tome je što su one u pravilu predmet analize, au slučaju fetusa citogenetička metoda podrazumijeva korištenje staničnih kultura čiji je izbor određen nizom čimbenika. Glavni je trajanje trudnoće. Na primjer, s ovim razdobljem kraćim od 12 tjedana, citogenetičku analizu kromosoma najbolje je učiniti uz sudjelovanje stanica koriona, a s razdobljem trudnoće dužim od 12 tjedana, preporučljivo je uzeti u obzir stanice samog fetusa za istraživanje. . U tu svrhu posebno su izolirani iz placente i fetalne krvi.

Za utvrđivanje kariotipa, citogenetičko nasljeđe zahtijeva uzimanje uzorka krvi u količini od najmanje 1-2 ml. Štoviše, sama metoda uključuje provođenje istraživanja koje se sastoji od tri glavne faze:

Izolacija i na kojoj će se analiza provoditi;

Bojanje preparata;

Provođenje temeljite analize lijeka pod mikroskopom.

Citogenetička metoda genetike može biti učinkovita samo kada su ispunjeni sljedeći uvjeti. Prvo, mora postojati određeni broj stanica koje su u fazi metafaze. Drugo, uzgoj se mora provoditi u strogom skladu s utvrđena pravila i to u trajanju od najmanje 72 sata. Treće, fiksiranje stanica treba provesti otopinom metanola u strogom omjeru ovih tvari 3:1.

U fazi bojanja preparata, izbor boja se vrši uzimajući u obzir samu svrhu studije, odnosno kakvu vrstu preuređivanja treba proučavati. Najčešće se koristi metoda kontinuiranog bojenja, jer je najjednostavnija za određivanje kvantitativnog parametra kromosoma. Najviše se koriste suvremena istraživanja ovu metodu bojenje za određivanje abnormalnosti kariotipa u njihovoj kvantitativnoj ekspresiji. Ali ova citogenetička metoda ne omogućuje određivanje i otkrivanje strukturne dinamike kromosoma. Stoga drugi koriste posebne metode, koji vam omogućuju izravnavanje ovaj nedostatak metoda kontinuiranog bojenja. Najčešći od njih, kao što su metoda diferenciranog bojanja, G-metoda, R-metoda i drugi.

I konačno, treća faza studije sastoji se od mikroskopskog pregleda obojenih kromosoma koji su u fazi metafaze. Tijekom nje se utvrđuje broj normalnih i abnormalnih stanica u tijelu ljudskog fetusa. Da bi se to učinilo, u pravilu se analizira nekoliko tkiva.

Temelj metode je mikroskopska studija kromosoma. Citološke studije postale su naširoko korištene od ranih 20-ih. XX. stoljeća. proučavati morfologiju kromosoma, kultiviranje leukocita za dobivanje metafaznih ploča.

Razvoj moderne ljudske citogenetike povezan je s imenima citologa D. Tio i A. Levan. Godine 1956. prvi su ustanovili da ljudi imaju 46 kromosoma, što je označilo početak širokog proučavanja ljudskih mitotskih i mejotičkih kromosoma.

Godine 1959. francuski znanstvenici D. Lejeune, R. Turpin i M. Gautier ustanovili su kromosomsku prirodu Downove bolesti. U narednim godinama opisani su mnogi drugi kromosomski sindromi koji se često nalaze u ljudi. Citogenetika je postala najvažnija grana praktične medicine. Trenutno se citogenetička metoda koristi za dijagnosticiranje kromosomskih bolesti, sastavljanje genetskih karata kromosoma, proučavanje procesa mutacije i drugih problema ljudske genetike.

Godine 1960. prvi Međunarodna klasifikacija ljudski kromosomi. Temelji se na veličini kromosoma i položaju primarne konstrikcije – centromere. Svi kromosomi se po obliku dijele na metacentrične, submetacentrične i akrocentrične i podijeljeni u 7 skupina, označenih latiničnim slovima A, B, C, D, E, F, G. Svakom paru kromosoma dodijeljen je redni broj od 1 do 22. , posebno istaknuti i nazvani latiničnim slovima - X i Y spolni kromosomi.

Godine 1971. na Praškoj genetičkoj konferenciji, osim Denverske klasifikacije, predstavljene su i metode diferencijalnog bojanja kromosoma, zahvaljujući kojima svaki kromosom dobiva svoj jedinstveni uzorak, što pomaže u točnoj identifikaciji.

Osnovni podaci o morfologiji ljudskih kromosoma dobiveni su njihovim proučavanjem u metafazama mitoze i profazi – metafazi mejoze. Važno je da je broj stanica koje se dijele bio visok. Najvažniji citogenetski rad obavljen je na limfocitima periferne krvi, jer uzgojem limfocita tijekom 2-3 dana u prisutnosti fitohemaglutinina moguće je dobiti metafazne ploče za kromosomsku analizu.

Jednoslojne metafazne ploče s odvojeno ležećim kromosomima podvrgavaju se citogenetskoj analizi. Da bi se to postiglo, stanice koje se dijele tretiraju se kolhicinom i određenim kemikalijama.

Važna faza citogenetske analize je bojenje dobivenih preparata. Provodi se jednostavnim diferencijalnim i fluorescentnim metodama.

Napredak u ljudskoj molekularnoj citogenetici omogućuje razvoj novih metoda za proučavanje kromosoma. Stoga je vrijedno istaknuti metodu fluorescentne hibridizacije, koja omogućuje proučavanje širokog spektra pitanja: od lokalizacije gena do dešifriranja složenih preraspodjela između nekoliko kromosoma.

Stoga kombinacija citogenetskih i molekularno genetičkih metoda u humanoj genetici čini mogućnosti dijagnosticiranja kromosomskih abnormalnosti gotovo neograničenima.


Najnoviji medicinska oprema a suvremene tehnike omogućuju klijentima privatnih centara da upoznaju moguće patologije u ljudskom razvoju i prije rođenja. Citogenetička metoda istraživanja– analiza kojom se mogu identificirati postojeće promjene na kromosomskom aparatu. Prije svega, utvrđuju se anomalije u setu samih kromosoma, kao i prisutnost različitih strukturnih preuređivanja. Ova citogenetička studija najčešće se koristi za pravovremenu dijagnozu prirođenih i opasnih stečenih bolesti.

Primjerice, u onkologiji i s njom povezanoj onkohematologiji vrlo je važno pravovremeno utvrditi vrstu kromosomskih translokacija karakterističnih za pojedine tumorske stanice. Utvrđivanje njihove prisutnosti omogućuje vam da brzo i najispravnije odaberete taktiku liječenja. Takav postupak je složen i višefazan, a rezultat u potpunosti ovisi o iskustvu osoblja i kvaliteti opreme, stoga nema potrebe riskirati život i pokušavati uštedjeti na ovoj analizi. Svaki pojedini zadatak može zahtijevati zasebnu studiju, stoga je za pacijenta vrlo važno izvršiti analizu ispravno i "ispravno prvi put".

Ako je potrebno analizirati ne cijelu strukturu kromosoma, već samo pojedinačne sekvence DNA ili RNA, koristite molekularna citogenetička studija. Omogućuje vam proučavanje određenih gena, a zbog svoje visoke točnosti često se koristi za otkrivanje minimalnih manifestacija rezidualnih bolesti. Na primjer, ova se metoda preporučuje za rano otkrivanje recidiva tumora: male leukemijske stanice jednostavno se ne mogu otkriti drugim metodama na takvim rani stadiji. Obično se citogenetičko ispitivanje krvi provodi metodom lančane reakcije polimerazom. Ova tehnologija vam omogućuje da dobijete veliki broj identične kopije DNK regije koja se proučava. Otvara se mogućnost posjedovanja više kopija dodatne mogućnosti istražiti sekvencu DNK koristeći moderne i tradicionalne metode.

Citogenetička studija kariotipa

DO standardne procedure citogenetski test krvi uključuje kariotipizaciju. Uz njegovu pomoć otkrivaju se abnormalnosti u broju i strukturi kromosoma. Vrlo je važno dati prednost klinici s visokokvalitetnom opremom i potrošni materijal. Za analizu kariotipa, uzorci krvnih stanica čuvaju se u hranjivom mediju 3 dana. Zatim se dobiveni materijal fiksira i pregleda pod mikroskopom. U tim fazama morate pažljivo pratiti kvalitetu posebnih pripravaka za bojenje i razinu obuke osoblja.

Postoji također fetalni citogenetski pregled, propisuje se za razne sumnje na genetske abnormalnosti ili za abnormalni rani intrauterini razvoj. Privatni medicinski centri mogu pružiti odgovarajuću razinu takvih istraživanja i identificirati različite kromosomske patologije, malformacije, neplodnost ili nemogućnost rađanja djeteta u ranoj fazi trudnoće ili prije nje.

Citogenetička studija koštane srži propisano pacijentima s različite vrste maligne bolesti u organima hematopoetskog sustava. Tijekom ove analize procjenjuje se najmanje 20 stanica. Mora se uzeti u obzir da prikupljanje materijala za istraživanje treba provoditi samo u posebnom zdravstvena ustanova, koji ima dopuštenje za obavljanje takvih opasnih intervencija.

U ranoj trudnoći možda ćete trebati citogenetička studija koriona. Provodi se u 10-14 tjednu trudnoće kako bi se isključile kromosomske bolesti fetusa kao što su Downov sindrom, Hunterova bolest, b-talasemija i još oko 50 abnormalnosti i bolesti. Obrativši se privatnom centru, klijent može biti siguran u kvalitetu usluge i pouzdanost dobivenih rezultata moderna oprema rezultati ispitivanja.

Citogenetička studija je mikroskopska analiza kromosoma čiji su rezultati vrlo važni za dijagnozu, klasifikaciju, liječenje i znanstveno istraživanje bolesti krvnog sustava, prvenstveno onkohematoloških. Važnost citogenetskih metoda za dijagnostiku i liječenje određena je dostupnošću tumorskih stanica za kariotipizaciju i njihovom heterogenošću, a sa znanstvenog gledišta mogućnošću proučavanja promjena u strukturi i funkciji genetskih lokusa povezanih s malignom transformacijom.

Morfologija kromosoma uvelike varira tijekom staničnog ciklusa. Za mikroskopsku analizu kromosomi se moraju vizualizirati kao diskretne strukture. To se najbolje postiže u fazi prometafaze mitoze, kada je svaki kromosom vidljiv kao dvije identične kromatide, a posebno u fazi metafaze, kada su kromosomi maksimalno kondenzirani i smješteni u istoj ravnini u središtu stanice, odvojeno od jedne još.
Normalan Stanice Ljudski kromosomi sadrže 22 para autosoma i jedan par spolnih kromosoma: dva X kromosoma u žena i jednu kopiju spolnih kromosoma (X i Y) u muškaraca.

Za citogenetsku analizu leukemija, mijelodisplastičnih sindroma i kroničnih mijeloproliferativnih bolesti ispituju se stanice koštane srži. Ako ih je nemoguće dobiti, može se pregledati krv (ako sadrži blaste). Citogenetička analiza limfoma provodi se u stanicama tkiva limfnog čvora. Uzgoj stanica iz tumora povećava mitotski indeks (udio stanica u mitozi) i potiče proliferaciju malignih stanica.

Usporedna kariotipizacija normalnih stanica provodi se u T-limfocitima periferne krvi koji su prethodno uzgojeni u mediju s mitogenom. biljnog porijekla- fitohemaglutinin.

Bojanje kromosoma u hematologiji

U kasnim 1960-ima, metodologija za diferencijal metafazno bojenje kromosoma, a 1971. stvorena je nomenklatura kromosomskih segmenata za točan opis kromosomskih abnormalnosti. Kasnije su uvedene tehnike bojenja manje kondenziranih i sukladno tome duljih profaznih i prometafaznih kromosoma, koje imaju veću rezoluciju jer omogućuju vizualizaciju 500-2000 segmenata (metafazno bojanje vizualizira samo 300 segmenata).

Dosta velik broj profazne i prometafazne stanice za analizu dobivaju se sinkronizacijom staničnog ciklusa uzgojem stanica u mediju koji sadrži antimetabolit (npr. metotreksat) koji inhibira sintezu DNA. Inhibicija sinteze DNA zaustavlja stanični ciklus u interfazi. Stanice se zatim prenose u medij bez metotreksata s dodatkom timidina, gdje istovremeno ulaze u fazu mitoze. Tretiranje stanične kulture kolhicinom zaustavlja mitozu istovremeno u svim stanicama u fazi profaze ili prometafaze.

Prva trajna kromosomska abnormalnost u ljudskim malignim tumorima identificiran je 1960. godine kod pacijenata s kroničnom mijeloičnom leukemijom i nazvan je Philadelphia kromosom (Ph), po gradu u kojem je ovo otkriće napravljeno. Korištenje tehnologije kromosomskog bojenja omogućilo je prepoznavanje mnogih kromosomskih abnormalnosti, od kojih se većina javlja u onkohematološkim bolestima. Neke boje boje različite regije kromosoma promjenjivim intenzitetom ovisno o strukturi kromatina u tim regijama, njihovom nukleotidnom i proteinskom sastavu.

Kao rezultat ovoga bojenje dobiti jedinstveni uzorak izmjeničnih svijetlih i tamnih poprečnih pruga, specifičnih za svaki kromosom.

Trenutno postoji nekoliko vrsta diferencijalno bojenje kromosoma. Kod Q-bojenja s kinakrinom ili kinakrinskim dihidrokloridom otkriva se posebna vrsta fluorescencije svakog kromosoma uz stvaranje Q-traka - poprečnih fluorescentnih traka koje se nazivaju Q-trake. To omogućuje identifikaciju pojedinačnih kromosoma. Analiza Q-pojasa provodi se pomoću fluorescentnog mikroskopa.

Shema analize DNA metodom FISH

Na Bojenje po Giemsi(G-banding) kromosomi poprimaju izgled niza tamnih i svijetlih pruga ili traka. G-bojanje se koristi češće nego Q-bojanje jer se analiza izvodi pomoću svjetlosnog mikroskopa, a G-trake, za razliku od Q-traka, ne blijede tijekom vremena. Najčešće korištena tehnika naziva se GTG bojenje (G trake pomoću tripsina pomoću Giemse), uz prethodnu obradu tripsinom.

R-pojas(tretiranje kromosoma vrućom alkoholnom otopinom prije bojanja po Giemsi) otkriva trake koje su obrnute od G vrpci i nazivaju se R vrpce (obrnuto od G vrpci).

osim Q-, G- i R-bojanje, čime je moguće otkriti vrpce duž cijele duljine kromosoma, postoje tehnike specijalizirane za proučavanje pojedinačnih kromosomskih struktura, uključujući konstitutivni heterokromatin (C-bojanje - od engleskog constitutive), telomernu regiju (T-bojenje) i područje nukleolnog organizatora (NOR-bojenje - od engleskog nucleolus organising region). Veličina i položaj C vrpci jedinstveni su za svaki kromosom, ali oni pretežno uključuju centromernu regiju i koriste se u proučavanju kromosomskih translokacija koje uključuju centromerne regije kromosoma.

Citogenetička analiza tumorskih stanica teško zbog nejasne morfologije kromosoma i slabe vidljivosti vrpci. Ako se u studiju uzmu najprikladnije metafazne ploče za analizu, uzorak se može pogrešno okarakterizirati kao citogenetski normalan.

S razvojem metode rekombinantne DNA Postalo je moguće koristiti in situ hibridizaciju za određivanje položaja na kromosomima ili u staničnoj jezgri bilo koje sekvence DNA ili RNA. Uz njegovu pomoć možete proučavati i dijagnosticirati rak i nasljedne genetske bolesti. Molekularna in situ hibridizacija važan je alat za citogenetičke studije; ona omogućuje otkrivanje kromosomskih preraspodjela, identifikaciju kromosoma markera i brzu kariotipizaciju staničnih linija. Važno je da se takva analiza može provesti ne samo na metafaznim kromosomima, već i na interfaznim jezgrama.

Razlučivost “interfazne citogenetike” dva je reda veličine veća od one klasične citogenetike.

Unatoč višenamjenskoj upotrebi DNA-DNA (RNA) molekularna in situ hibridizacija, sve modifikacije metode izvode se u skladu s generalni principi. Postoji nekoliko opcija koje uključuju nekoliko faza: priprema i označavanje DNA (RNA) sonde, priprema kromosomskih preparata, sama hibridizacija, detekcija hibridnih molekula.

Osamdesetih godina prošlog stoljeća citogenetička metodologija obogaćena je molekularnom citogenetičkom metodom tzv. fluorescentna in situ hibridizacija (fluorescentna in situ hibridizacija, RIBA), koja je ubrzo postala najpopularnija. Bit ove metode je hibridizacija DNA sondi na specifične DNA sekvence obilježene fluorokromima s metafaznim ili interfaznim kromosomima, koji se vizualiziraju fluorescentnom mikroskopijom. Određivanje nukleotidnog slijeda pomoću FISH-a izvodi se neizravno hibridizacijom sintetskog oligonukleotida (sonde) s DNA koja se analizira (također se naziva predložna DNA ili ciljna DNA).

Ako je sonda sintetizirana tako da uključuje fluorescentne ili antigene molekule koje se prepoznaju fluorescentna antitijela, postaje moguće vizualizirati relativni položaj sonde na analiziranoj DNK.

Fluorokrom može biti povezan s DNK kovalentno (izravno označavanje) ili kroz imunocitokemijske reakcije, gdje je DNA sonda obilježena haptenom (biotin, digoksigenin), a fluorokrom je povezan s alkaloidom avidinom (streptavidin), koji ima jak afinitet za biotin (ili s antitijelima protiv biotina ili digoksigenin). Pri korištenju haptena moguće je pojačanje fluorescentnog signala pomoću biotiniliranih protutijela na avidin i sekundarnih protutijela specifičnih za prethodni sloj protutijela i obojenih fluorokromom.

Za pojačanje fluorescentni signal Koristi se metoda "imunološkog sendviča". Na primjer, pripravak prikazan na dijagramu obložen je biotiniliranim antitijelima na avidin, a zatim ponovno kompleksom avidin-fluorescein. Ako je potrebno, ciklus se može ponoviti. Protutijela se, pak, otkrivaju pomoću enzimskog (na primjer, avidin peroksidaze) ili fluorescentnog detektora.

FISH metoda dizajniran da identificira:
1) hibridne stanice;
2) translokacije i druge, uključujući numeričke, kromosomske abnormalnosti;
3) obilježeni kromosomi u stanicama interfaze i metafaze.

Fluorescentna hibridizacija visokog kontrasta postiže se upotrebom fluorescentne boje različite boje. Dvobojni FISH otkriva suptilne strukturne abnormalnosti, kao što su kromosomske translokacije, uključujući one koje se ne mogu razlikovati diferencijalnim bojanjem.

Trenutno je moguće proizvoditi višebojne in situ hibridizacija za istovremeno bojenje svih kromosoma u složenom kariotipu s više numeričkih i strukturnih abnormalnosti. Kombinacija različitih modificirajućih sredstava i fluorokromnih boja omogućuje istovremenu detekciju više sekvenci DNA u jednoj jezgri (fluorescein daje zelenu fluorescenciju, teksas crvena i rodamin - crvenu, hidroksikumarin - plavu itd.). Kombinacija pet fluorokroma u različitim omjerima i računalna analiza slike omogućuje istovremeno bojanje različite boje sve kromosome i vizualizirajte 27 različitih DNK sondi koje služe kao jedinstvena oznaka za svaki kromosom. Ova tehnika se naziva višebojna FISH (multicolor, ili multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).

Značenje citogenetske metode varira u različitim onkohematološkim bolestima. Mijeloične stanice se obično lako kariotipiziraju diferencijalnim bojanjem, a FISH samo potvrđuje rezultate rutinske citogenetike. Limfne stanice u bolesnika s kroničnom limfocitnom leukemijom i, posebice, multiplim mijelomom, mnogo je teže odrediti kariotip zbog niske razine proliferacije (čak i pri korištenju B-staničnih mitogena). U ovom slučaju FISH pokazuje nekoliko puta veću učestalost aneuploidije od konvencionalnih citogenetskih tehnika.

Klinički značaj citogenetskih studija

Dijagnoza. Potomstvo stanice sa stečenom citogenetičkom abnormalnošću može imati proliferativnu prednost i dovesti do klona, ​​stanične populacije koja potječe od jedne progenitorske stanice. Otkrivanje klonskih kromosomskih abnormalnosti olakšava dijagnozu klonskih lezija koštane srži. Na primjer, citogenetska analiza omogućuje postavljanje dijagnoze mijelodisplastičnog sindroma u bolesnika s umjerenom citopenijom ili u prisutnosti minimalno izraženih kvalitativnih poremećaja hematopoeze u aspiratu koštane srži.

Omska državna medicinska akademija

Zavod za propedeutiku dječjih bolesti i izvanbolničku pedijatriju

Potvrđujem:

glava odjel Lukyanov A.V.

“_____” 20__

Medicinska genetika

Metode medicinske genetike – citogenetike

OMSK – 2001

ODOBRIO SAM

glava odjelu

“___” 20___

METODIČKA IZRADA praktične nastave za studente četvrte godine Pedijatrijskog fakulteta

Tema lekcije : Metode medicinske genetike – Citogenetika

Relevantnost teme : Značajan dio višestrukih prirođenih malformacija, poremećaja spolnog i psihomotornog razvoja u djece povezan je s promjenama broja ili strukture kromosoma. Napredak u prepoznavanju neovisnih kromosomskih sindroma, u njihovoj dijagnostici u svakom konkretnom slučaju, kao iu prevenciji i liječenju nemoguć je bez proučavanja strukture i funkcija kromosoma i osnovnih metoda njihova proučavanja.

Svrha lekcije : Proučava strukturu i klasifikaciju ljudskih kromosoma, glavne metode istraživanja su kariotipizacija i analiza spolnog kromatina. Odrediti glavne sindrome uzrokovane kromosomskim abnormalnostima i indikacije za citogenetsku metodu istraživanja.

Učenik mora znati:

    Građa, funkcija i klasifikacija kromosoma čovjeka (biologija).

    Numeričke i strukturne abnormalnosti kromosoma.

    Polimorfizam kromosomskih sindroma (patofiziologija).

    Metode citogenetskih istraživanja (biologija).

Student mora biti sposoban:

    Identificirati fenotipske znakove kromosomskih sindroma u djece.

    Odrediti indikacije za proučavanje kariotipa i spolnog kromatina.

    Protumačiti zaključke citogenetičara o prisutnosti kromosomske patologije u probanda.

Oprema za nastavu :

    tablice, dijapozitivi, fotografije, situacijski zadaci, preparati metafaznih ploča ljudskih kromosoma, preparati bukalnog epitela, setovi reagensa, svjetlosni mikroskop.

Trajanje lekcije : 140 minuta

Mjesto lekcije : učionica, citogenetski laboratorij

Metodologija izvođenja nastave :

1. Provjera prisutnih 10 minuta

2. Formulacija teme 10 min

3. Rješavanje situacijskih problema 30 min

4. Rasprava o gradivu 65 min

5. Odgovori na pitanja 10 min

6. Zaključak nastavnika i domaća zadaća 10 min

Esej

Humana citogenetika zauzima jedan od najvažnija mjesta u medicinskoj genetici. Predmet citogenetskih istraživanja su kromosomi (grč. obojenost– 'boja' i soma- 'tijelo'; V. Waldeer, 1888) - strukturni elementi stanične jezgre, koji sadrže glavni dio nasljednih informacija. Ovisno o funkcionalnoj aktivnosti i stadiju staničnog ciklusa u kromosomima, DNA može biti raspoređena u različitim gustoćama. Događaji koji se odvijaju u stanici tijekom procesa mitotičke diobe odvijaju se pravilnim slijedom i sastoje se od pet izmjeničnih faza: interfaza, profaza, metafaza, anafaza i telofaza. Mitotski kromosomi nastaju u stanici tijekom mitoze; DNK u njima je jako zbijena. To osigurava ravnomjernu raspodjelu genetskog materijala između stanica kćeri tijekom mitoze. Interfazni kromosomi (kromatin) aktivno sudjeluju u procesima transkripcije i replikacije.

Oblik metafaznih kromosoma određen je položajem primarnog suženja – centromera, koji ga dijeli na dva kraka jednake ili nejednake duljine – telomera. Kratki krak kromosoma označen je slovom " str", dugo – " q". Razlikuju se metacentrični, submetacentrični i akrocentrični kromosomi.

Somatske stanice ljudi imaju stalni dvostruki diploid ( 2n) skup kromosoma ili kariotip koji se sastoji od dva pojedinačna haploidna skupa ( n) dobili od roditelja. U ljudskim somatskim stanicama diploidni set sastoji se od 46 kromosoma (22 para autosoma i par spolnih kromosoma). Normalni set spolnih kromosoma kod žena predstavljen je kromosomima XX, a kod muškaraca kromosomima XY. U zametnim stanicama sadrži haploidni set kromosoma.

Klasifikacija jednolično obojeni kromosomi razvijeni su na međunarodnim sastancima u Denveru (1960.), Londonu (1963.) i Chicagu (1966.). Kromosomi su raspoređeni prema smanjenoj duljini. Svi parovi autosoma su numerirani arapski brojevi od 1 do 22. Spolni kromosomi se označavaju latiničnim slovima X i Y i stavljaju se na kraj rasporeda tijekom kariotipizacije. Poredani navedenim redoslijedom, svi autosomi podijeljeni su u sedam skupina, koje se međusobno razlikuju po duljini i obliku svojih sastavnih članova i označene su slovima engleski alfabet od A do G. Skupina A (1-3) sadrži tri para najvećih kromosoma: 1, 3 – metacentrični kromosomi i 2 – submetacentrični. Grupa B (4-5) uključuje 2 para dugih submetacentričnih kromosoma. Skupina C (6-12) ujedinjuje sedam parova submetacentričnih autosoma i kromosom X koji se od njih ne razlikuje. Skupina D (13-15) uključuje tri para akrocentričnih kromosoma, a skupina E (16-18) uključuje tri para submetacentričnih kromosoma. Grupa F (19-20) sadrži dva para malih metacentričnih kromosoma, grupa G (21-22) sadrži dva para najmanjih akrocentričnih kromosoma. Y kromosom se izdvaja kao samostalan kromosom.

Pojavom metoda diferencijalnog bojenja (G, Q, C) postalo je moguće identificirati kromosome izmjenom svijetlih (eukromatin) i tamnih (heterokromatin) pruga, karakterističnih za svaki par, smještenih simetrično u sestrinskim kromatidama (Pariz, 1971. ).

Svaki kromosom je diferenciran u 2 vrste različitih regija, takozvane eu- i heterokromatske regije. Eukromatske, aktivne regije - sadrže cijeli glavni kompleks nuklearnih gena, tj. dijelovi kromosomske niti koji različito kontroliraju razvoj karakteristika organizma. Heterokromatske regije tvore distalne i proksimalne dijelove kromosomske niti, a također su i dio njegovih unutarnjih dijelova. Uloga heterokromatskih regija kromosoma, evolucijski fiksiranih u njihovoj strukturi, trenutno se aktivno proučava.

Među genomski mutacije istaknuti:

    poliploidija– povećanje broja kromosoma višestruko od haploidnog broja n (3n, 4nitd.);

    aneuploidija– odstupanje broja kromosoma od euploidnog broja. Među aneuploidijama postoje:

    monosomija ( 2n–1) – nepostojanje jednog kromosoma za odgovarajući par,

    trisomija ( 2n+1) – prisutnost 3 homologna kromosoma umjesto uobičajenog para;

    mozaicizam– prisutnost više od jedne populacije stanica s različitim brojem kromosoma u istoj osobi.

Strukturne prilagodbe Može biti uravnotežena, kada je redoslijed segmenata u kromosomima poremećen, ali općenito se količina genetskog materijala ne mijenja:

    inverzija – rotacija dijela kromosoma za 180°,

    translokacije – izmjena dijelova kromosoma; Može biti recipročan uz međusobnu izmjenu odsječaka između dva nehomologna kromosoma i Robertsonian– translokacije između dva akrocentrična kromosoma.

Neuravnotežen do preraspodjele dolazi kada postoji gubitak ili višak kromosomskog materijala:

    delecije – gubitak dijela kromosoma;

    duplikacija – udvostručenje dijela kromosoma;

    izokromosomi su kromosomi koji se sastoje od dva kratka kraka.

Dobitak ili gubitak kromosomskog materijala označen je znakom "+" odnosno "–" ispred broja kromosoma ( 47 ,XY +21).

Citogenetičke metode analize dijele na izravne i neizravne. Neizravne metode uključuju, kao obvezni korak, uzgoj stanica u umjetnim hranjivim medijima. Materijal su limfociti periferne krvi i krvi pupkovine fetusa, fibroblasti kože i amnionske tekućine, stanice spontano pobačenih embrija i germinativne ovojnice. Direktne metode koriste se u slučajevima kada je potreban brzi rezultat i kada je moguće dobiti preparate kromosoma stanica koje se dijele u tijelu. Izvor takvih stanica je koštana srž i stanice germinativne membrane. Glavni predmet citogenetskih istraživanja izravnim i neizravnim metodama je metafazni stadij mitoze i različiti stadiji mejoze. Metafaza mitoze služi kao glavni objekt za analizu kromosomske garniture, jer Upravo je u ovoj fazi moguća točna identifikacija kromosoma i otkrivanje njihovih anomalija.

Tijekom mitoze svaki se kromosom sastoji od dvije jednako duge tanke niti, koje se nazivaju sestrinske kromatide, koje su stisnute u čvrste strukture, dajući izgled kratkih krakova koje zajedno drži centromera. U metafazi, kada je njihova duljina najveća, kromosomi se dijele u parove. Takva sistematizacija kromosoma iz jedne stanice naziva se kariotip. Tijekom laboratorijskih pretraga analizira se 10-40 metafaznih kariotipova za svakog bolesnika. Ako se sumnja na mozaicizam, potrebno je analizirati kako veći broj stanica tako i stanice iz drugih tkiva.

Indikacije za proučavanje kariotipa probanda

    Multiple kongenitalne malformacije i mikroanomalije u novorođenčadi i njihovih roditelja.

    Mentalna retardacija, usporeni fizički i neuropsihički razvoj u kombinaciji s kongenitalnim anomalijama.

    Kršenje spolne diferencijacije.

    Primarna i sekundarna amenoreja.

    Neplodnost.

    Žene sa spontanim pobačajima, habitualni spontani pobačaji, mrtvorođenče.

    Rođaci prvog koljena probanda koji imaju strukturne preuređene kromosome.

Za prepoznavanje promjena u sustavu spolnih kromosoma koriste se: ekspresne metode:

    Određivanje spolnog X‑kromatina u interfaznim jezgrama bukalnih epitelnih stanica. Svaka stanica sadrži samo jedan genetski aktivan X kromosom. Citološka manifestacija neaktivnog X kromosoma je kromatinska masa (Barrovo tijelo), koja se nalazi na periferiji interfazne jezgre. Broj Barrovih tjelešaca može se koristiti za procjenu broja neaktivnih X kromosoma. Na primjer, u ćelijama koje se koriste žensko tijelo (46,XX), s Klinefelterovim sindromom otkriva se 1 Barrovo tijelo. U stanicama muškog tijela iu većini epitelnih stanica u Turnerovom sindromu ( 45,X0) spolni X-kromatin je odsutan. Postoji pravilo da je broj tijela spolnog kromatina jednak broju X kromosoma minus 1 ( B=X–1 ).

    DefinicijaY-kromatin. U interfaznoj jezgri, kada se boji luminiscentnim bojama (Q-metoda), Y kromosom izgleda kao jarko fluorescentna nakupina kromatina. Testovi X- i Y-kromatina ne bi trebali služiti kao apsolutno pouzdani dijagnostički testovi za patološke promjene spolnih kromosoma. Konačan odgovor može se dobiti samo analizom kariotipa pacijenta.

Indikacije za određivanje spolnog kromatina

    Poremećaj spolne diferencijacije.

    Sumnja na sindrom Shereshevsky-Turner, Klinefelter.

    Amenoreja.

    Neplodnost.

    Intrauterino određivanje spola u X-vezanim bolestima.

Klinički polimorfizam kromosomskih sindroma uzrokovan je različitim anomalijama autosoma i spolnih kromosoma. Kod kromosomskih sindroma postoji oštra neravnoteža gena, ali ukupni utjecaj genoma stvara polimorfizam kliničkih znakova.

Značajke manifestacije autosomne ​​patologije

    Karakteriziran višestrukim kongenitalnim malformacijama.

    U pratnji grubog intelektualnog defekta ili oštrog kašnjenja u psihomotornom razvoju.

    Očekivano trajanje života bolesnika nije značajno.

    Dijagnoza ove patologije moguća je od rođenja.

Od numeričkih anomalija autosoma moguće je rađanje djece s trisomijom 21 kromosoma (Downov sindrom), 13 kromosoma (Patauov sindrom), 18 kromosoma (Edwardsov sindrom), a rjeđe su trisomije 8 i 9 kromosoma. Trisomija za skupine A i B kromosoma nije opisana među živorođenom djecom.

Među neuravnoteženim strukturnim anomalijama moguće je rađanje djece sa sindromima djelomične monosomije, na primjer, Cri of the Cat sindrom (brisanje kratkog kraka kromosoma 5), ​​Wolf-Hirschkornov sindrom (brisanje kratkog kraka kromosoma 4), Arbelijev sindrom (delecija kratkog kraka 13. kromosoma), Lejeuneov sindrom (brisanje kratkog kraka 18. kromosoma). Slučaj djelomične monosomije su prstenasti kromosomi. Moguća je djelomična trisomija kromosoma 6-11.

Značajke manifestacije patologije spolnih kromosoma

    Karakteristična izolirana lezija unutarnji organi i mikroanomalije.

    Inteligencija je malo smanjena.

    Očekivano trajanje života je normalno.

Među numeričkim anomalijama spolnih kromosoma najčešća je monosomija X kromosoma ( 45,X0– tipičan oblik Shereshevsky–Turnerovog sindroma), trisomija X kromosoma u žena ( 47,XXX) i disomija kod muškaraca ( 47, XXY– Klinefelterov sindrom), moguća disomija Y kromosoma ( 47, XYY).

Od strukturnih anomalija, moguće je otkriti u kariotipu X izokromosom koji se sastoji od dva duga kraka ( 46, Xi (Xq)), delecije X kromosoma ( 46, Xdel(x) (q11)), prsten X kromosoma ( 46, X, r(x)).

U većini slučajeva kromosomske abnormalnosti su sporadične, tj. nastaju kao nova mutacija s normalnim kariotipom oba roditelja probanda. U takvim slučajevima rizik za braću i sestre procjenjuje se korištenjem empirijskih podataka za svaku vrstu anomalije, uzimajući u obzir dob majke. Rizik je veći kada majka nosi uravnoteženu reorganizaciju od oca. U nizu slučajeva, prilikom pregleda roditelja probanda, u jednom od njih otkriva se mozaicizam, tj. neke od stanica imaju isti abnormalni kariotip kao onaj probanda. Rizik za braću i sestre izračunava se pomoću formule:

x

×K

2

gdje je x udio abnormalnog staničnog klona, ​​K je koeficijent eliminacije neuravnoteženih zigota u embriogenezi (za Downov sindrom K = ½).

Trenutno postoje različiti režimi liječenja niza kromosomskih sindroma, uključujući hormonsku terapiju i kiruršku korekciju defekata. Važno za prevenciju rođenja djece s kromosomskim sindromom je genetsko savjetovanje obitelji, proučavanje kariotipa roditelja, izračun rizika od ponovnog rođenja djeteta s kromosomskom patologijom, korištenje kompleksa izravnih metoda prenatalne dijagnostike (ultrazvuk fetusa, studija alfa-fetoproteina, amniocenteza, biopsija korionskih resica, kordocenteza itd.) kako bi se riješilo pitanje uputnosti održavanja očito neperspektivne trudnoće.

Učestalost fenotipskih znakova u Shereshevsky-Turnerovom sindromu prema pubertetu (pravilni i mozaični oblici)

Znakovi

Učestalost (%)

1. Nizak rast

2. "Štitnjača" prsni koš

3. Široko razmaknute bradavice

4. Deformacija tijela prsne kosti

5. Čvrst turgor tkiva

6. Antimongoloidni oblik oka

7. Epikantus

8. Deformacija ušiju

9. Krilni nabor na vratu

10. Limfedem

11. Mentalna retardacija

12. Primarna amenoreja

13. Dijabetes melitus

14. Obilje staračkih pjega

16. Lučno nebo

17. Nizak rast dlaka na vratu

18. Hipoplazija ili abnormalna struktura vanjskih genitalija

19. Kongenitalne anomalije mokraćnog sustava

20. Urođene srčane mane

21. Abnormalnosti kostura