Сучасні цитогенетичні методи Методи генетики


Цитогенетика є самостійним розділом вчення про спадковість, в якому досліджуються різні, перш за все, спостережувані (експліковані) носії, що містять у собі інформацію про генетичну спадковість. Такими носіями виступають хромосоми. різних типів(політені, мітотичні та мейотичні), пластиди, інтерфазні ядра, і, найменшою мірою - мітохондрії.

Виходячи з цього, цитогенетичний метод є сукупністю способів і технологій вивчення, перш за все, хромосом, в ході яких встановлюється їх кількісний параметр, виробляється їх хіміко-біологічний опис, досліджується структура та режими поведінки під час клітинного поділу. Науковим завданням даного дослідження є встановлення зв'язку між характером та динамікою зміни структури хромосом та картиною, що відображає мінливість ознак.

Одним із найважливіших напрямів дослідження, що передбачає цитогенетичний метод, є проведення аналізу каріотипу людини. Дане дослідження, як правило, проводять на культурах, в яких відбувається розподіл статевих та соматичних клітин.

Найпоширеніша культура для таких досліджень - клітини периферичної крові, такі як лімфоцити, фібробласти і клітини кісткового мозку. Найдоступнішою культурою, яка використовується в медичній цитогенетиці, є лімфоцити крові. Причина цього полягає в тому, що, як правило, вони є предметом аналізу і при плоді цитогенетичний метод передбачає використання клітинних культур, вибір яких обумовлений низкою факторів. Головним із них є термін вагітності. Наприклад, при цьому терміні менше 12 тижнів, цитогенетичний аналіз хромосом найкраще робити за участю клітин хоріону, а при термінах вагітності більше 12 тижнів, доцільно для дослідження розглядати клітини самого плода. З цією метою вони спеціально виділяються з плаценти та крові плода.

Для встановлення каріотипу цитогенетична спадковість вимагає отримання зразка крові у кількості не менше 1-2 мл. При цьому сам метод передбачає проведення дослідження, що складається з трьох основних етапів:

Виділення та на яких здійснюватиметься аналіз;

Забарвлення препарату;

Проведення ретельного аналізу препарату під мікроскопом.

Ефективним цитогенетичним методом генетики може бути лише тоді, коли будуть дотримані наступні умови. По-перше, має бути певна кількість клітин, що перебувають у метафазній стадії. По-друге, культивування має проводитися у суворій відповідності до встановленими правиламита протягом періоду не менше 72 годин. По-третє, фіксація клітин повинна проводитися розчином і метанолу у суворому співвідношенні цих речовин 3: 1.

На етапі фарбування препарату для вибору кольорів проводиться з урахуванням самої мети дослідження, тобто, який тип перебудов необхідно вивчити. Найчастіше, використовують метод суцільного фарбування, оскільки він найпростіший визначення кількісного параметра хромосом. Сучасні дослідження найбільше застосовують даний методфарбування визначення аномалій каріотипу у тому кількісному вираженні. Але такий цитогенетичний метод не дає можливості визначити та виявити структурну динаміку хромосом. Тому застосовують інші, спеціальні методи, які дозволяють нівелювати даний недолікметоду суцільного фарбування. Найбільш поширені з них, такі як метод диференційованого забарвлення, G-метод, R-метод та інші.

І, нарешті, третій етап дослідження полягає у мікроскопічному вивченні забарвлених хромосом, що у метафазної стадії. У ході нього встановлюється кількість нормальних та аномальних за своїм станом клітин організму плоду людини. Для цього зазвичай проводиться аналіз декількох тканин.

Основа методу – мікроскопічне вивчення хромосоми. Цитологічні дослідження почали широко використовуватися початку 20-гг. ХХ ст. для вивчення морфології хромосом, культивування лейкоцитів для одержання метафазних пластинок.

Розвиток сучасної цитогенетики людини пов'язане з іменами цитологів Д.Тіо та А.Левана. У 1956 р. вони першими встановили, що у людини 46 хромосомщо поклало початок широкому вивченню мітотичних та мейотичних хромосом людини.

У 1959 р. французькі вчені Д. Лежен, Р. Тюрпен та М. Готьє встановили хромосомну природу хвороби Дауна. У наступні роки було описано багато інших хромосомних синдромів, що часто зустрічаються у людини. Цитогенетика стала найважливішим поділом практичної медицини. В даний час цитогенетичний метод застосовується для діагностики хромосомних хвороб, складання генетичних карток хромосом, вивчення мутаційного процесу та інших проблем генетики людини.

У 1960 р. в Денвері була розроблена перша Міжнародна класифікаціяхромосом людини. В її основу лягли розміри хромосом та положення первинної перетяжки – центроміри. Усі хромосоми за формою поділені на метоцентричні, субметацентричні та акроцентричні та поділені на 7 груп, позначених латинськими літерами А, В, С, D, E, F, G. Кожна пара хромосом була наділена порядковим номером від 1 до 22, виділено окремо та пойменовано латинськими літерами – Х та У статеві хромосоми.

У 1971 р. на Празькій конференції генетиків у доповненні до Денверської класифікації були представлені методи диференціального забарвлення хромосом, завдяки яким кожна хромосома набуває свого неповторного малюнку, що допомагає точної ідентифікації.

Основні відомості про морфологію хромосом людини отримані при вивченні їх у метафазах мітозу та профазі – метафазі мейозу. При цьому важливо, кількість клітин, що діляться, була високою. Найважливіші цитогенетичні роботи виконані на лімфоцитах периферичної крові, оскільки культивування лімфоцитів протягом 2-3 діб у присутності фітогемаглютиніну дозволяє отримати метофазні пластинки для хромосомного аналізу.

Цитогенетичного аналізу піддають одношарові метафазні пластинки з хромосомами, що окремо лежать. Для цього клітини, що діляться, обробляють кольхіцином і деякими хімічними речовинами.

Важливим етапом цитогенетичного аналізу є забарвлення одержаних препаратів. Її проводять простими диференціальними та флуоресцентними методами.

Успіхи молекулярної цитогенетики людини дозволяють розробити нові способи вивчення хромосом. Так, слід зазначити метод флуоресцентної гібридизації, який дає можливість досліджувати широке коло питань: від локалізації гена до розшифрування складних перебудов між кількома хромосомами.

Таким чином, поєднання цитогенетичних та молекулярно-генетичних методів у генетиці людини робить майже необмеженими можливості діагностики хромосомних аномалій.


Новітнє медичне обладнаннята сучасні методики дозволяють клієнтам приватних центрів дізнатися про можливі патології у розвитку людини ще до її народження. Цитогенетичний метод дослідження– аналіз, за ​​допомогою якого можна встановити наявні зміни у хромосомному апараті. Насамперед з'ясовуються аномалії у самому наборі хромосом, а також наявність різноманітних структурних перебудов. Таке цитогенетичне дослідження найчастіше застосовується для своєчасної діагностики вроджених та небезпечних набутих захворювань.

Так, наприклад, в онкології та суміжній з нею онкогематології дуже важливо вчасно встановити тип хромосомних транслокацій, характерний для певних пухлинних клітин. Встановлення їх наявності дозволяє швидко та максимально правильно підібрати тактику лікування. Подібна процедура складна та багатоступінчаста, а результат повністю залежить від досвідченості персоналу та якості обладнання, тому не потрібно ризикувати своїм життям та намагатися заощадити на даному аналізі. Для кожного окремого завдання може знадобитися окреме дослідження, тому виконання аналізу правильно і «з першого разу» дуже важливе для пацієнта.

Якщо необхідно проаналізувати не всю хромосомну структуру, а лише окремі послідовності ДНК чи РНК, використовується молекулярно-цитогенетичне дослідження. Воно дозволяє вивчити ті чи інші гени, а завдяки своїй високій точності – часто застосовується для виявлення мінімальних проявів залишкових хвороб. Наприклад, цей спосіб рекомендують для раннього виявлення пухлинних рецидивів: дрібні лейкемічні клітини просто не можна виявити іншими способами на таких ранніх термінах. Зазвичай цитогенетичне дослідження крові проводиться на основі способу полімеразної ланцюгової реакції. Така технологія дозволяє отримати велика кількістьідентичних копій досліджуваної ділянки ДНК Наявність безлічі копій відкриває додаткові можливостідосліджувати послідовність ДНК, як новітніми, і традиційними методами.

Цитогенетичне дослідження каріотип

До стандартним процедурам цитогенетичного аналізу кровівідноситься каріотипування. З його допомогою виявляють порушення у кількості та структурі хромосом. Дуже важливо віддати перевагу клініці, з якісним обладнанням та витратними матеріалами. Для аналізу каріотип, забір клітин крові тримають у живильному середовищі протягом 3 діб. Потім відбувається фіксація отриманого матеріалу та вивчення під мікроскопом. На цих етапах потрібно ретельно простежити за якістю спеціальних фарбуючих препаратів та рівнем підготовки персоналу.

Існує також цитогенетичне дослідження плодайого призначають при різних підозрах на генетичні відхилення або при неправильному ранньому внутрішньоматковому розвитку. Приватні медичні центри можуть забезпечити належний рівень проведення подібних досліджень та виявити різні хромосомні патології, вади розвитку, безплідність чи неможливість виносити дитину на ранніх термінах вагітності або до неї.

Цитогенетичне дослідження кісткового мозкупризначають пацієнтам з різними видамизлоякісних захворювань органів системи кровотворення. Під час цього аналізу оцінюється щонайменше 20 клітин. Потрібно враховувати, що забір матеріалу для дослідження повинен проводитися лише у спеціальному медичній установі, що має дозвіл на проведення таких небезпечних втручань.

На ранніх термінах вагітності може знадобитися цитогенетичне дослідження хоріону. Його проводять на 10-14 тижні вагітності з метою виключення хромосомних хвороб плода, таких як синдром Дауна, хвороба Хантера, b-таласемія та ще близько 50 різних відхилень та захворювань. Звернувшись у приватний центр, клієнт може бути впевнений у якості обслуговування та достовірності отриманих на сучасне обладнаннярезультати аналізів.

Цитогенетичне дослідження- це мікроскопічний аналіз хромосом, результати якого дуже важливі для постановки діагнозу, класифікації, лікування та наукового дослідженнязахворювань системи крові, насамперед – онкогематологічних. Значення цитогенетичних методів для діагнозу та лікування визначається доступністю пухлинних клітин для каріотипування та їх гетерогенністю, а з наукової точки зору – можливістю вивчення змін у структурі та функції генетичних локусів, асоційованих зі злоякісною трансформацією.

Морфологія хромосомсильно варіює під час клітинного циклу. Для мікроскопічного аналізу хромосоми мають бути візуалізовані як дискретні структури. Найкращим чином досягається на стадії прометафази мітозу, коли кожна хромосома видно як дві ідентичні хроматиди, і особливо на стадії метафази, коли хромосоми максимально конденсовані і розташовуються в одній площині в центрі клітини окремо одна від іншої.
Нормальні клітинилюдини містять 22 пари аутосом і одну пару статевих: дві Х-хромосоми у жінок та по одній копії статевих хромосом (X та Y) у чоловіків.

Для цитогенетичного аналізу лейкозів, мієлодиспластичних синдромів та хронічних мієлопроліферативних захворювань досліджують клітини кісткового мозку При неможливості отримання може бути досліджена кров (якщо вона містить бласти). Цитогенетичний аналіз лімфом виконується у клітинах тканини лімфатичного вузла. Культивування клітин з пухлини підвищує мітотичний індекс (пропорцію клітин, що знаходяться у фазі мітозу) та сприяє проліферації злоякісних клітин.

Порівняльне каріотипування нормальних клітинпроводять у Т-лімфоцитах периферичної крові, які попередньо культивують у середовищі з мітогеном рослинного походження- Фітогемагглютиніном.

Фарбування хромосом у гематології

Наприкінці 1960-х років було розроблено методологію диференціального фарбування метафазних хромосом, а 1971 р. створено номенклатуру хромосомних сегментів, що дозволяє точно описувати хромосомні аномалії. Пізніше були впроваджені методики фарбування менш конденсованих і, відповідно, довших профазних і прометафазних хромосом, які мають більш високу роздільну здатність, оскільки дозволяють візуалізацію 500-2000 сегментів (метафазне фарбування візуалізує лише 300 сегментів).

Досить велика кількість профазних та прометафазних клітиндля аналізу отримують шляхом синхронізації клітинного циклу, культивуючи клітини в середовищі, що містить антиметаболіт (наприклад, метотрексат), який пригнічує синтез ДНК. Пригнічення синтезу ДНК зупиняє клітинний цикл інтерфазі. Потім клітини переносять у середу без метотрексату, збагачену тимідином, де вони одночасно входять у фазу мітозу. Обробка клітинної культури колхіцином зупиняє мітоз одночасно у всіх клітинах на стадії профази або прометафази.

Перша стійка хромосомна аномаліяпри злоякісній пухлині людини була виявлена ​​в 1960 р. у хворих на хронічний мієлолейкоз і отримала назву філадельфійської хромосоми (Ph), на ім'я міста, в якому було зроблено це відкриття. Застосування технології хромосомного фарбування дозволило виявити безліч хромосомних аномалій, більшість яких зустрічається при онкогематологічних захворюваннях. Деякі барвники фарбують різні ділянки хромосом з варіабельною інтенсивністю залежно від структури хроматину в цих ділянках, їх нуклеотидного та білкового складу.

В результаті такого фарбуванняотримують унікальний патерн чергування світлих і темних поперечних смуг, специфічний кожної хромосоми.

Нині існують кілька видів диференціального фарбування хромосом. При Q-фарбуванні акрихін-іпритом (quinacrine) або акрихиндигидрохлоридом виявляється особливий тип флюоресценції кожної хромосоми з утворенням Q-смугастість (Q-banding) - поперечних флюоресцентних смуг, званих Q-полосами (Q.-bands). Це дозволяє ідентифікувати окремі хромосоми. Аналіз Q-смуг виконують за допомогою флюоресцентного мікроскопа.

Схема аналізу ДНК методом FISH

При фарбуванні по Гімзі(G-banding) хромосоми набувають вигляду серії темних і світлих смуг або бендів (bands). G-фарбування застосовується частіше, ніж Q-фарбування, оскільки аналіз виконується за допомогою світлового мікроскопа, а G-смуги, на відміну від Q-смужок, не вицвітають з часом. Найбільш широко застосовується методика, звана GTG-фарбуванням (Gbands by trypsin using Giemsa), з попередньою обробкою трипсином.

R-бендінг(Обробка хромосом гарячим спиртовим розчином перед фарбуванням по Гімзі) виявляє смуги, які обернені G-смужками і називаються R-смугами (reverse of G bands).

Крім Q-, G- та R-фарбування, що дозволяють виявляти смуги вздовж усієї довжини хромосоми, існують методики, спеціалізовані для дослідження окремих хромосомних структур, у тому числі конститутивного гетерохроматину (С-фарбування - від англ. constitutive), теломірного району (Т-фарбування) та району ядерного організатора (NOR- - від англ. Nucleolus organizing region). Розміри та положення С-смуг унікальні для кожної хромосоми, але переважно вони включають центромірний район і використовуються при дослідженні хромосомних транслокацій, що залучають центромірні райони хромосом.

Цитогенетичний аналіз пухлинних клітинутруднений у зв'язку з незрозумілою морфологією хромосом і слабкою помітністю смуг. Якщо в дослідження взято найбільш зручні для аналізу метафазні платівки, зразок може бути помилково охарактеризований як цитогенетично нормальний.

З розвитком методів рекомбінантної ДНКстало можливим використання гібридизації in situ для визначення розташування на хромосомах або клітинному ядрі будь-якої ДНК-і РНК-послідовності. З її допомогою можна вивчати та діагностувати онкологічні та спадкові генетичні хвороби. Молекулярна гібридизація in situ є важливим інструментом цитогенетичних досліджень, що дозволяє виявляти хромосомні перебудови, ідентифікувати маркерні хромосоми, проводити швидке каріотипування клітинних ліній. Важливо, що такий аналіз можна проводити як на метафазних хромосомах, а й на інтерфазних ядрах.

Роздільна здатність «інтерфазної цитогенетики» на два порядки вища, ніж класичної цитогенетики.

Незважаючи на багатоцільове використання молекулярної гібридизації ДНК-ДНК (РНК) in situ, всі модифікації методу виконуються відповідно до загальними принципами. Існують кілька варіантів, які включають кілька етапів: підготовка і мічення ДНК (РНК)-зонда, приготування препаратів хромосом, власне гібридизація, детекція гібридних молекул.

У 1980-х роках цитогенетична методологія збагатилася молекулярно-цитогенетичним методом флюоресцентною гібридизацією in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), який незабаром став найпопулярнішим. Суть цього методу полягає у гібридизації ДНК-зондів до специфічних послідовностей ДНК, мічених флюорохромами, з метафазними або інтерфазними хромосомами, що візуалізуються флюоресцентною мікроскопією. Визначення нуклеотидної послідовності методом FISH виконується непрямим способом, шляхом гібридизації синтетичного олігонуклеотиду (зонда) з аналізованої ДНК (также називається матричною ДНК або ДНК-мішенню).

Якщо зонд синтезований із включенням флюоресцентних або антигенних молекул, які розпізнаються флюоресцентними антитіламистає можливою візуалізація відносного положення зонда на аналізованій ДНК.

Флюорохром може бути пов'язаний з ДНКковалентно (пряме перебіг) або за допомогою імуноцитохімічних реакцій, коли ДНК-зонд мітять гаптеном (біотин, дигоксигенін), а флюорохром пов'язаний з алкалоїдом авідином (стрептавідином), що має сильну спорідненість до біотину або з антитілами проти біотину. При використанні гаптенів можлива ампліфікація флюоресцентного сигналу за допомогою біотинілованих антитіл до авідину та вторинних антитіл, специфічних попередньому шару антитіл та пофарбованих флюорохромом.

Для ампліфікації флюоресцентного сигналузастосовується метод "імунних сендвічів". Наприклад, препарат, зображений на схемі, наносять біотиніловані антитіла до авідину, а потім знову комплекс авідин-флюоресцеїн. За потреби цикл може бути повторений. Антитіла, у свою чергу, виявляються за допомогою ферментативного (наприклад, авідинпероксидази) або флюоресцентного детектора.

Метод FISHпризначений для виявлення:
1) гібридних клітин;
2) транслокацій та інших, у тому числі числових, хромосомних аномалій;
3) мічених хромосом в інтерфазних та метафазних клітинах.

Висококонтрастна флюоресцентна гібридизація досягається завдяки використанню флюоресцентних барвників різного кольору. За допомогою двоколірної FISH виявляються тонкі структурні аномалії, наприклад, хромосомні транслокації, у тому числі й нерозрізні при диференційному фарбуванні.

В даний час можливе виконання багатобарвної гібридизації in situдля одночасного фарбування всіх хромосом у складному каріотипі з множинними числовими та структурними аномаліями. Комбінація різних модифікуючих агентів та флюорохромних барвників дозволяє одночасно виявляти кілька послідовностей ДНК в одному ядрі (флюоресцеїн дає зелену флюоресценцію, техаський червоний та родамін – червону, гідроксикумарин – блакитну тощо). Поєднання п'яти флюорохромів у різних пропорціях та комп'ютерний аналіз зображень дозволяє одночасно пофарбувати різним кольоромвсі хромосоми і візуалізувати 27 різних ДНК-зондів, які є унікальною міткою для кожної хромосоми. Ця методика називається багатобарвною FISH (multicolor, або multiplex, fluorescence in situ hybridization, M-FISH).

Значення цитогенетичних методівнеоднаково при різних онкогематологічних захворюваннях. Мієлоїдні клітини зазвичай легко каріотипуються при диференціальному фарбуванні, і FISH лише підтверджує результати рутинної цитогенетики. Лімфоїдні клітини у хворих на хронічний лімфолейкоз і, особливо, множинною мієломою каріотипувати значно складніше через низький рівень проліферації (навіть при використанні В-клітинних мітогенів). У цьому випадку FISH демонструє у кілька разів більшу частоту анеуплоїдії, ніж звичайні цитогенетичні методики.

Клінічне значення цитогенетичних досліджень

Діагноз. Нащадки клітини з набутою цитогенетичною аномалією може мати проліферативну перевагу і давати початок клону - клітинній популяції, що походить від однієї клітини-попередниці. Виявлення клональних хромосомних аномалій сприяє постановці діагнозу клонального ураження кісткового мозку. Наприклад, цитогенетичний аналіз дозволяє встановити діагноз мієлодиспластичного синдрому у пацієнтів з помірною цитопенією або за наявності в аспіраті кісткового мозку мінімально виражених якісних порушень гемопоезу.

Омська Державна Медична Академія

Кафедра пропедевтики дитячих хвороб та поліклінічної педіатрії

Затверджую:

Зав. кафедрою Лук'янов О.В.

"_____" 20__ р.

Медична генетика

Методи медичної генетики – цитогенетичний

ОМСК - 2001

ЗАТВЕРДЖУЮ

Зав. кафедрою

"___" 20___ р.

МЕТОДИЧНА РОЗРОБКА до практичного заняття для студентів IV курсу педіатричного факультету

Тема заняття : Методи медичної генетики – Цитогенетичний

Актуальність теми : Значна частина множинних вроджених вад розвитку, порушень статевого та психомоторного розвитку у дітей пов'язана зі змінами числа або структури хромосом. Успіхи у виділенні самостійних хромосомних синдромів, у їх діагностиці у кожному конкретному випадку, а також профілактиці та лікуванні неможливі без вивчення структури та функцій хромосом, основних методів їх дослідження.

Мета заняття : Вивчити будову та класифікацію хромосом людини, основні методи дослідження – каріотипування та аналіз статевого хроматину. Визначити основні синдроми, причиною яких є хромосомні аномалії та показання для цитогенетичного методу дослідження.

Студент повинен знати:

    Будова, функцію та класифікацію хромосом людини (біологія).

    Числові та структурні аномалії хромосом.

    Поліморфізм хромосомних синдромів (патофізіологія)

    Методи цитогенетичного дослідження (біологія).

Студент повинен вміти:

    Виявити фенотипові ознаки хромосомних синдромів у дітей.

    Визначити показання для дослідження каріотипу та статевого хроматину.

    Інтерпретувати висновки лікаря-цитогенетика щодо наявності хромосомної патології у пробанда.

Оснащення заняття :

    таблиці, слайди, фотографії, ситуаційні завдання, препарати метафазних пластинок хромосом людини, препарати буккального епітелію, реактивні набори, світловий мікроскоп.

Тривалість заняття : 140 хвилин

Місце проведення заняття : навчальна кімната, цитогенетична лабораторія.

Методика проведення заняття :

1. Перевірка присутніх 10 хв.

2. Формулювання теми 10 хв

3. Вирішення ситуаційних завдань 30 хв

4. Обговорення матеріалу 65 хв

5. Відповіді на запитання 10 хв

6. Висновок викладача та завдання додому 10 хв

Реферат

Цитогенетика людинизаймає одне з найважливіших місцьу медичній генетиці. Об'єктом цитогенетичних досліджень є хромосоми (грец. chroma- 'колір' і soma- 'тіло'; В. Вальдеєр, 1888 р) – структурні елементи ядра клітини, які у собі основну частину спадкової інформації. Залежно від функціональної активності та стадії клітинного циклу у складі хромосом ДНК може бути укладена з різною щільністю. Події, що розгортаються в клітині в процесі мітотичного поділу протікають в закономірній послідовності і складають п'ять стадій, що змінюються: інтерфаза, профаза, метафаза, анафаза і телофаза. Мітотичні хромосоми утворюються в клітині під час мітозу, ДНК у них покладена надзвичайно щільно. Завдяки цьому забезпечується рівномірний розподіл генетичного матеріалу між дочірніми клітинами при мітозі. Інтерфазні хромосоми (хроматин) беруть активну участь у процесах транскрипції та реплікації.

Форма метафазних хромосом визначається положенням первинної перетяжки – центроміри, яка ділить її на дві рівних або нерівних по довжині плеча – теломери. Коротке плече хромосоми позначають літерою. p", довге -" qВиділяють метацентричні, субметацентричні та акроцентричні хромосоми.

Соматичні клітинилюдини мають постійний подвійний диплоїдний ( 2n) набір хромосом або каріотип, який складається з двох одинарних гаплоїдних наборів ( n), отриманих від батьків. У соматичних клітинах людини диплоїдний набір складають 46 хромосом (22 пари аутосом та пара статевих хромосом). Нормальний набір статевих хромосом у жінок представлений ХХ та у чоловіків – XY хромосомами. У статевих клітинахміститься гаплоїдний набір хромосом.

Класифікаціярівномірно забарвлених хромосом вироблена на міжнародних нарадах у Денвері (1960), Лондоні (1963) та Чикаго (1966). Хромосоми розташовуються як зменшення їх довжини. Усі пари аутосом нумерують арабськими цифрамивід 1 до 22. Статеві хромосоми позначають латинськими літерами X і Y і при каріотипування поміщають наприкінці розкладки. Розташовані у зазначеному порядку, всі аутосоми розподіляються на сім груп, які різняться між собою за довжиною та формою складових їх членів та позначаються буквами англійського алфавітувід A до G. У групі A (1–3) виявляються три пари найбільших хромосом: 1, 3 – метацентричні хромосоми та 2 – субметацентрична. Група B (4-5) включає 2 пари довгих субметацентричних хромосом. Група С (6–12) поєднує сім пар субметацентричних аутосом і не відрізняється від них Ххромосому. До групи D (13–15) входять три пари акроцентричних хромосом, а до групи Е (16–18) – три пари субметацентричних хромосом. Група F (19–20) містить дві пари маленьких метацентричних хромосом, група G (21–22) – дві пари найдрібніших акроцентричних хромосом. Y‑хромосома виділяється як самостійна.

З появою методів диференціального забарвлення (G, Q, C) з'явилася можливість ідентифікувати хромосоми характерним для кожної пари чергуванням світлих (еухроматин) і темних (гетерохроматин) смуг, розташованих симетрично в сестринських хроматидах (Париж, 1971).

Кожна хромосома диференційована на 2 типи різних районів, так звані еу-і гетерохроматичні райони. Еухроматичні, активні райони – містять основний комплекс генів ядра, тобто. ділянок хромосомної нитки, що диференціально контролюють розвиток ознак організму. Гетерохроматичні райони утворюють дистальні та проксимальні ділянки хромосомної нитки, а також входять до складу її внутрішніх частин. Роль гетерохроматичних районів хромосом, еволюційно закріплених у тому структурі, нині активно вивчається.

Серед геномних мутаційвиділяють:

    поліплоїдії– збільшення кількості хромосом, кратне гаплоїдному числу n (3n, 4nі т.д.);

    анеуплоїдії- Відхилення кількості хромосом від еуплоїдних чисел. Серед анеуплоїдій виділяють:

    моносомії ( 2n–1) – відсутність однієї хромосоми для відповідної пари,

    трисомії ( 2n+1) – наявність 3-х гомологічних хромосом замість звичайної пари;

    мозаїцизм- Присутність більше однієї популяції клітин з різним числом хромосом у однієї і тієї ж людини.

Структурні перебудовиможуть бути збалансованими, коли порядок розташування сегментів у хромосомах порушений, але загалом, кількості генетичного матеріалу не змінюється:

    інверсії - поворот ділянки хромосоми на 180 °,

    транслокації – обмін ділянками хромосом; можуть бути реципрокнимипри взаємному обміні ділянками між двома негомологічними хромосомами та робертсонівськими– транслокації між двома акроцентричними хромосомами.

Незбалансованіперебудови виникають при втраті або надлишку хромосомного матеріалу:

    делеції – втрата частини хромосоми;

    дуплікації – подвоєння ділянки хромосоми;

    Ізохромосоми - хромосоми, що складаються з двох коротких плечей.

Збільшення або втрату хромосомного матеріалу позначають відповідно знаком "+" або "-", що розміщується перед номером хромосоми ( 47 , XY +21).

Методи цитогенетичного аналізуділяться на прямі та непрямі. Непрямі методи включають як обов'язковий етап культивування клітин у штучних живильних середовищах. Матеріалом є лімфоцити периферичної крові та пуповинної крові плода, фібробласти шкіри та амніотичної рідини, клітини спонтанно абортованих ембріонів та зародкових оболонок. Прямі методи застосовують у тих випадках, коли необхідний швидкий результат і є можливість отримати препарати хромосом клітин, що діляться в організмі. Джерелом таких клітин є кістковий мозок та клітини зародкових оболонок. Основним об'єктом цитогенетичного дослідження прямими та непрямими методами є стадія метафази мітозу та різні стадії мейозу. Метафаза мітозу є основним об'єктом для аналізу хромосомного набору, т.к. саме на цій стадії можлива точна ідентифікація хромосом та виявлення їх аномалій.

Під час мітозу кожна хромосома складається з двох однаково довгих тонких тяжів, які називаються сестринськими хроматидами, що стискаються в щільні структури, у зв'язку з чим створюється враження коротких плечей, що підтримуються разом за допомогою центроміру. У метафазі, коли їхня довжина найбільша, хромосоми розбиваються на пари. Подібна систематизація хромосом із однієї клітини називається каріотипом. Під час лабораторних досліджень у кожного пацієнта аналізується 10–40 метафазних каріотипів. При підозрі на мозаїцизм необхідно аналізувати як більшу кількість клітин, і клітини інших тканин.

Показання для дослідження каріотипу пробанда

    Множинні вроджені вади розвитку та мікроаномалії у новонароджених дітей та їх батьків.

    Олігофренія, затримка фізичного та нервово-психічного розвитку у поєднанні з вродженими аномаліями.

    Порушення диференціювання статі.

    Первинна та вторинна аменорея.

    Безпліддя.

    Жінки зі спонтанними абортами, звичними мимовільними абортами, мертвінням.

    У родичів пробанда першого ступеня спорідненості, що має структурні перебудови хромосом.

Для виявлення змін у системі статевих хромосом використовуються наступні експрес-методи:

    Визначення статевого Х-хроматинув інтерфазних ядрах клітин букального епітелію. Кожна клітина містить лише одну генетично активну Х-хромосому. Цитологічним проявом неактивної Х-хромосоми служить хроматинова маса (тіле Барра), що виявляється на периферії інтерфазного ядра. За кількістю тілець Барра можна судити про кількість неактивних Х-хромосом. Наприклад, у використовуваних клітинах жіночого організму (46,ХХ), при синдромі Клайнфельтера визначається 1 тільце Барра. У клітинах чоловічого організму та у більшості епітеліальних клітин при синдромі Тернера ( 45,Х0) статевий Х-хроматин відсутня. Існує емпіричне правило, згідно з яким число тілець статевого хроматину дорівнює числу Х-хромосом мінус 1 ( В = Х-1 ).

    ВизначенняY‑хроматину. В інтерфазному ядрі при фарбуванні люмінесцентними барвниками (Q-метод) Y-хромосома виглядає яскраво флюоресцентним скупченням хроматину. Проби на Х- і Y-хроматин не повинні служити абсолютно достовірними для діагностики при патологічній зміні статевих хромосом. Остаточну відповідь можна отримати лише при аналізі каріотипу пацієнта.

Показання для дослідження статевого хроматину

    Порушення статевого диференціювання.

    Підозра на синдроми Шерешевського-Тернера, Клайнфельтера.

    Аменорея.

    Безпліддя.

    Внутрішньоутробне визначення статі при Х-зчеплених захворюваннях.

Клінічний поліморфізм хромосомних синдромів зумовлений різними аномаліями аутосом та статевих хромосом. При хромосомних синдромах відзначається різкий дисбаланс генів, але загальний вплив геному створює поліморфізм клінічних ознак.

Особливості прояву аутосомної патології

    Характеризується множинними вродженими вадами розвитку.

    Супроводжується грубим дефектом інтелекту чи різкою затримкою психомоторного розвитку.

    Тривалість життя хворих незначна.

    Діагностика цієї патології можлива від народження.

Серед числових аномалій аутосом можливе народження дітей із трисомією 21 хромосоми (синдром Дауна), 13 хромосоми (синдром Патау), 18 хромосоми (синдром Едвардса), рідше зустрічаються трисомії 8 та 9 хромосом. Трисомія за групами А та В хромосом серед живонароджених не описана.

Серед незбалансованих структурних аномалій можливе народження дітей з синдромами часткової моносомії, наприклад синдром котячого крику (делеція короткого плеча 5 хромосоми), синдром Вольфа-Хіршкорна (делеція короткого плеча 4 хромосоми), синдром Арбелі (делеція короткого плеча 13 хромосоми) короткого плеча (18 хромосоми). Випадком часткової моносомії є кільцеві хромосоми. Можлива часткова трисомія 6-11 хромосом.

Особливості прояву патології статевих хромосом

    Характерно ізольована поразка внутрішніх органівта мікроаномалії.

    Інтелект знижений трохи.

    Тривалість життя звичайна.

Серед числових аномалій статевих хромосом з найбільшою частотою зустрічаються моносомія Х-хромосоми ( 45,Х0- Типова форма синдрому Шерешевського-Тернера), трисомія Х-хромосоми у жінок ( 47,ХХХ) та дисомія у чоловіків ( 47, XXY- синдром Клайнфельтера), можлива дисомія Y-хромосоми ( 47, XYY).

Зі структурних аномалій можливе виявлення в каріотипі Х-ізохромосоми, що складається з двох довгих плечей ( 46, Xi (Xq)), делеції Х-хромосоми ( 46, Xdel(X) (q11)), кільцевих Х-хромосом ( 46, Х, r(Х)).

Найчастіше хромосомні аномалії носять спорадичний характер, тобто. виникають у вигляді нової мутації за нормального каріотипу обох батьків пробанда. У разі ризик для сибсов оцінюється за емпіричними даними кожного типу аномалій з урахуванням віку матері. Ризик вище при носії збалансованої перебудови у матері, ніж у батька. Нерідко під час обстеження батьків пробанда в будь-кого їх виявляється мозаїцизм, тобто. частина клітин має такий самий аномальний каріотип, як у пробанда. Ризик для сибсов розраховується за такою формулою:

х

×К

2-х

де х – частка аномального клітинного клону, К – коефіцієнт елімінації незбалансованих зигот в ембріогенезі (при синдромі Дауна К=½).

В даний час існують різні схеми лікування цілого ряду хромосомних синдромів, що включають гормональну терапію та хірургічну корекцію дефектів. Важливим для профілактики народження дітей з хромосомними синдромами є генетичне консультування сім'ї, дослідження каріотипу батьків, розрахунок ризику повторного народження дитини з хромосомною патологією, використання комплексу прямих методів пренатальної діагностики (ультразвукове сканування плоду, дослідження альфа-фетопротеїну, коріотизу, амніоцентез та амніоцен). ) для вирішення питання про доцільність збереження свідомо неперспективної вагітності.

Частота фенотипічних ознак при синдромі Шерешевського-Тернера до періоду статевого дозрівання (регулярна та мозаїчні форми)

Ознаки

Частота (%)

1. Низьке зростання

2. "Щитовидна" грудна клітина

3. Широко розставлені соски

4. Деформація тіла грудини

5. Тестуватий тургор тканин

6. Антимонголоїдний розріз очей

7. Епікант

8. Деформація вушних раковин

9. Крилоподібна складка на шиї

10. Лімфатичні набряки

11. Олігофренія

12. Первинна аменорея

13. Цукровий діабет

14. Велика кількість пігментних плям

16. Аркоподібне небо

17. Низьке зростання волосся на шиї

18. Гіпоплазія чи аномальна будова зовнішніх геніталій

19. Вроджені аномалії сечовивідної системи

20. Вроджені вади серця

21. Аномалії скелета